影響凱氏定氮法測定粗蛋白準確性應注意的問題

隨著飼料行業(yè)的飛速發(fā)展，飼料原料及其飼料產品的價格也居高不下。而粗蛋白的檢測是評定飼料原料及其產品的重要指標之一，目前常用的為凱氏定氮法，即國家頒布的《飼料中粗蛋白的測定方法》(GB1996-6432)。但是該方法也存在著測定過程較復雜、費時等缺陷，測定時除嚴格按照規(guī)定程序操作外，還需要一定的實驗技巧和實踐經驗。因此有很多飼料企業(yè)在實際操作過程中總是出現(xiàn)各種問題，導致檢測結果異常而不知如何去分析。本文以GB/T6432-1994 為準，針對影響凱氏定氮對測定結果標準性應注意的細節(jié)問題和大家共同

探討。當然也有相對簡單的測定粗蛋白含量的方法，因為考慮到用國標法測定粗蛋白的復雜性，而有時候我們沒必要對粗蛋白的含量做很精確的測定時，我們可以考慮用粗蛋白測定儀或者ZDDN-II凱氏定氮儀來測定物質中粗蛋白的含量。雖然這種儀器相較于國標法測定準備度方面有所欠缺，但是簡單方便，而且更重要的原因是它測出的數(shù)據(jù)能夠達到我們需要的目的。

1粗蛋白的測定：試劑的配制

粗蛋白測定中所用的化學藥品如濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀( 硫酸鈉)、硫酸銨、蔗糖等均為化學純試劑，標定鹽酸標準溶液用的無水碳酸鈉為基準試劑。在配制試劑前一定要用p H 試紙或酸度計檢測一下蒸餾水是否為中性，所用的燒杯、試劑瓶等配液設備清洗干凈。

1.1 鹽酸標準溶液的配制

配制的鹽酸標準溶液盡量為低濃度，一般C(HCl)=0.02 ～ 0.05mol • L-1。低濃度雖然用量大，但可減少操作誤差和讀數(shù)誤差。配制鹽酸標準溶液一定要嚴格按照標準操作進行，基準無水碳酸鈉已定于270 ～ 300℃灼燒至恒重，稱準至0.0001g，做4 ～ 6 個平行樣，去掉最高值和最低值后取平均值，同時還要做空白試驗。鹽酸標準溶液的配制量盡量不要太多、使用時間太長，防止水分蒸發(fā)和鹽酸揮發(fā)而影響其濃度的準確性。

1.2 其他試劑的配制

400g • L-1 氫氧化鈉溶液、20g • L-1 硼酸溶液、混合指示劑(1g •L -1 甲基紅乙醇溶液與5g • L -1 溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合) 等主要是在稱量時要做到快、準、穩(wěn)，再就是防止使用時間太長，特別是混合指示劑不要超過3 個月。

2粗蛋白的測定：試樣的選取和制備

2.1 采樣

飼料原料及產品的容積和質量往往很大，因此所采集的樣品必須具有代表性，否則，即使一系列的分析工作非常精密、準確，其意義都不大，有時甚至會得出錯誤的結論，所以應采用正確的采樣方法。采樣應從具不同代表性的區(qū)域取幾個樣點，然后充分混合為整個飼料的代表樣品，然后再從中分出一小部分作為分析樣品。在采樣過程中應做到隨即、客觀，避免受人為和主觀因素的影響。還有一點應該注意，就是所采集的樣品必須具有一定數(shù)量。其采集數(shù)量的多少應視飼料原料和產品水分含量、顆粒大小、均勻程度以及平行樣的數(shù)量而酌情定奪。

2.2 分樣

所采集的樣品往往較多，而檢測時所用試樣往往較少，因此要對所采集的樣品進行縮分。在多數(shù)飼料公司以及檢測機構中一般采用方便簡單的四分法。有條件的單位可采用分樣器進行分樣。

2.3 粉樣

飼料的樣品一般為顆粒狀，所以要對所分得的試樣進行粉碎。粉碎所用的設備一般為咖啡磨或植物樣本粉碎機，試樣粉碎后一般過40 目篩，且一定要把粉碎后的試樣及粉碎機中殘留的部分清掃后充分混合均勻，避免粉碎的試樣分級而影響分析結果的準確性。對于一些不易粉碎的粗飼料如秸稈渣等在粉碎機中會剩留極少難以通過篩孔，這部分一定不要丟掉，應盡力弄碎后一并均勻混入樣品中，避免引起分析誤差。

2.4 稱樣

試樣的用量標準中規(guī)定為0.5 ～ 1g，為保證分析結果的準確性，在分析過程中應根據(jù)試樣蛋白質含量的高低來決定所稱試樣的重量，如濃縮料、魚粉、玉米蛋白粉、豆粕等高蛋白的試樣可控制在0.5 ～ 1g之間，玉米、秸稈、苜蓿等低蛋白、粗飼料試樣可適當增加到2 ～ 3g左右，以增加測定結果的準確性。還應注意一點，在稱量時盡量用電子分析天平，準確到0.0001g 且無損地放入凱氏燒瓶或者消化管中。

3 粗蛋白的測定：消化

3.1 催化劑及其用量

在環(huán)境污染小、價格便宜、催化效果好的前提下，目前催化劑多為硫酸銅和無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉)。其添加量不同公司差異較大，其中硫酸銅: 無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉) 主要有1∶9、1∶10、1∶15 和1∶17 等，國標為0.4g 硫酸銅和6g 無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉)，比例為1∶12。若添加量加大，消化液易結塊不易轉移；添加量減少，消化時間加長或者消化不完全。建議大家按國標執(zhí)行為好。亦可根據(jù)自己的經驗以及試樣的多少、消化的難易程度、蛋白含量的多少自行調整。

3.2 硫酸的用量

濃硫酸的用量應視試樣的重量、含水量及其所含蛋白高低而適當調整。對于體積大重量輕的粗飼料、高蛋白飼料或者含水量較高的試樣、淀粉含量多的精料, 應適當加大濃硫酸的用量，多為15mL 左右。這是由于此類樣品，濃硫酸在對其脫水和碳化是消耗量加大，當加入的濃硫酸量不足或者剛剛夠試樣脫水和碳化時就會出現(xiàn)燒干現(xiàn)象。反之則需加入10mL 左右。若通風柜的排風量較大時應適當多加濃硫酸2mL 左右，以防止?jié)饬蛩岬恼舭l(fā)而使其濃度降低，試樣消化不完全從而導致所測得的數(shù)值偏低。

3.3 消化溫度

剛開始時以低溫(200 ～ 300℃ ) 加熱，待試樣焦化泡沫消失后，逐步緩慢提高溫度(360～410℃ )。起初低溫加熱是為防止試樣起泡沫，而溢出燒瓶外或碳化后的顆粒粘附于燒瓶壁，導致消化不完全，所測結果偏低。對于富含脂肪或者在消化過程中易發(fā)泡的樣品，可在消化

前滴加少量消泡劑，如辛醇、液體石蠟等。

3.4 消化時間

消化時間也是許多文獻一直在探討的問題，也有許多快速消化法的研究。其消化時間的標準為消化呈透明藍綠色后，再加熱消化15min。根據(jù)蘇軍等研究表明，消化液澄清后再繼續(xù)消化30min 為宜。此試驗只是針對于蛋白含量低于蠶蛹的樣品，而對于蛋白含量高于蠶蛹的樣品，如進口魚粉、血粉、羽毛粉等并未進行試驗性研究。因此我個人認為，可根據(jù)試樣的重量、蛋白含量的多少以及消化的難易程度而適當調整消化液澄清后的消化時間。對于所稱試樣質量較多、蛋白含量高于蠶蛹或者難消化的試樣，消化液澄清后繼續(xù)消化的時間可控制在45m i n ～ 2h 不等，具體時間化驗工作者可根據(jù)自己的工作經驗而自行定奪。

3.5 消化液的轉移及定容

消化結束后，把凱氏燒瓶從電爐上取下，放在小鐵筐內冷卻。此時一定要注意安全，帶稍厚手套防止燙傷。冷卻至室溫后加入蒸餾水10 ～ 20m L，在等冷卻至室溫后轉移到100m L 容量瓶內。再轉移是為減少損失誤差，應在容量瓶口上加上漏斗，且要用少量蒸餾水多次洗滌燒瓶和漏斗( 即采用少量多次原則)，否則會因偶然誤差而導致測定結果偏低。轉移完成后不要立即定容，應冷卻至室溫后再定容。若未冷卻而定容，待冷卻后，體積縮小，從而使吸取的試樣分解液的量偏大，測定結果將偏高。若消化完畢冷卻后，消化液不能當天定容需隔夜保存時，應先將凱氏燒瓶內加入少量的蒸餾水，防止消化液結晶，再把凱氏燒瓶口用塑料布包好，防止吸收空氣中的氨而影響結果的準確性。消化液若結晶不易轉移時，可將凱氏燒瓶放在電爐上加熱一下，待結晶融化后再轉移。

4粗蛋白的測定：蒸餾

4.1 蒸汽發(fā)生器內水的體積及酸堿性

蒸汽發(fā)生器內的水的體積應控制在其容積的2/3 左右，并控制液面高度。水的體積過大易在沸騰后從蒸汽發(fā)生器中玻璃管中溢出燙傷工作人員；過少易產生的氣體壓力不足或蒸干蒸汽發(fā)生器發(fā)生事故。水加入的同時一同加入幾滴硫酸和幾滴混合指示劑，且保持水一直呈紫紅色，以防止水中含有氨態(tài)的氮溢出而影響測定值。

4.2 蒸餾裝置的氣密性

在蒸餾操作開始前一定要檢查一下蒸餾裝置的氣密性。各導管的接口及用久的橡皮管應重點檢查。添加消化液和堿液的玻杯口要擰緊、液封，防止產生的氨氣逸出。在檢查氣密性的同時還應打開冷凝水開關且要保持一定的流速，否則冷卻不完全。這是很容易忽視的問題，特別是初學者。

4.3 試樣分解液的移取要準確

在移取試樣分解液前先把容量瓶搖勻,把10m L 移液管用所要取的試樣分解液潤洗2 ～ 3 次后，再進行移取。移取時移液管應垂直于地面，視線與移液管刻度線平行。吸取完試樣液后把移液管放到反應室內自然流入反應室，切忌把移液管放到小玻杯內及用吸耳球吹移液管。最后再用少量蒸餾水沖洗一下小玻杯，并把棒狀玻塞塞緊。

4.4 氫氧化鈉溶液的加入量

在蒸餾過程中，反應室內溶液應保持堿性，堿的加入量一般為10m L 左右，若在消化時所加入的硫酸偏多，40% 氫氧化鈉溶液的量也要隨之增加，這樣才能保證除用于和硫酸及硫酸銅反應外，還有足以使氨根轉化為氨的堿量。加入的堿先放入小玻杯內，慢慢轉動棒狀玻塞，使堿緩慢流到反應室內，然后再將小玻杯內加入蒸餾水液封，切忌把棒狀玻塞提起加堿—特別是初學者，這樣會造成反應后生成的氨從玻口逸出，導致所測蛋白含量偏低。

4.5 蒸餾速度與氣流

蒸餾時產生的氣流一定要均勻，切忌熱力不穩(wěn)、中途中斷或蒸汽不足，否則反應室內溫度會降低，易產生倒吸；氣流過快硼酸吸收不完全。蒸餾的速度除與氣流有關外還與冷卻水的流速及電路的溫度有關。蒸餾速度快，反應液易被蒸汽帶出而使測定結果偏高；蒸餾速度慢，氨沒有被完全蒸餾出來而結果偏低。那么以什么樣的蒸餾速度為宜呢？據(jù)賈艷玲和冷柏忠(2000) 實踐證明： 蒸餾速度一般應控制在每分鐘蒸餾出液體在5 ～ 7mL 之間。

4.6 蒸餾時間

蒸餾時間多為5m i n，加入試樣分解液及氫氧化鈉后蒸餾4m i n , 使冷凝管末端離開硼酸液面后再蒸餾1m i n。但是標準中并未規(guī)定從何時開始計時，據(jù)謝文飛(2003) 的試驗證明，在蒸餾完4m i n 鐘后再多蒸餾1 ～ 2mi n 對結果沒有什么影響，所以可以從硼酸剛剛出現(xiàn)綠色時開始計時蒸餾4min( 硼酸出現(xiàn)綠色說明反映已經開始)。最終在4min 后是否蒸餾完全可用pH 試紙進行檢測。在蒸餾時還應注意硼酸的吸收溫度。硼酸是極弱的酸，只起吸收氨的作用，但要注意硼酸吸收液溫度不應超過40℃，否則氨的吸收減弱導致結果偏低。

4.7 反應室的冷卻與洗滌

首先在蒸餾完畢，將冷凝管末端用蒸餾水沖洗后，再將錐形瓶移開進行滴定。清洗反應室時嚴禁將蒸餾瓶兩側的閥門同時關閉，以免發(fā)生爆炸。反應室清洗一定要徹底，一是防止殘留液影響下次測定結果的正確性；二是給反應室降溫。如果反應室溫度很高，再加之加入的氫氧化鈉與硫酸反應放出的大量熱，易產生爆沸，將反應液沖入冷凝管，造成實驗失敗。另外反應室溫度高，反應劇烈，有部分氨硼酸吸收不完全而逸出，測得的結果將偏低。一般反應室溫度降至不燙手即可。

4.8 錐形瓶的預處理

錐形瓶往往用洗衣粉洗滌，再用自來水、蒸餾水沖洗。洗衣粉不易徹底沖洗干凈，導致錐形瓶內壁環(huán)境偏于堿性；另外各地自來水的p H 不同，所制的蒸餾水p H 有時也會偏離中性，這樣都會導致測定結果出現(xiàn)偏差。建議把錐形瓶進行預處理后再使用，其方法為：沖洗干凈的錐形瓶加入20mL 蒸餾水、2 滴混合指示劑，再用0.02mol •L -1 的鹽酸溶液或者0.02m o l • L -1 的氫氧化鈉溶液滴定至剛好由藍色變?yōu)榛壹t色，然后倒掉該液體后，再加硼酸吸收液25 ～ 35m L 和混合指示劑2 ～ 3 滴。若加入指示劑后硼酸為藍色，則說明硼酸中混入堿性物質或蒸餾水偏堿性，需重新配制硼酸溶液。錐形瓶的預處理雖然比較繁瑣，但是可減少由于錐形瓶本身環(huán)境的p H 偏離中性對測定結果的影響。

4.9 滴定

滴定是整個實驗過程的最后一步，至關重要，否則整個實驗將前功盡棄。滴定前把鹽酸標液瓶搖勻后，把酸式滴定管潤洗2 ～ 3 次后加入鹽酸標液排除氣泡，記下刻度值，開始滴定。滴定時一定要控制好滴定速度，待接收液由淺綠色逐漸變成無色時要放慢滴定速度，逐滴加入鹽酸標液，接收液變成淺紅色時為滴定終點，切勿滴過量。

5粗蛋白的測定：空白測定

5.1 試劑空白測定

另取凱氏燒瓶或者消化管一個，加入硫酸銅、無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉)、濃硫酸，其中每個藥品的加入量與試樣消化時的加入量相同，加熱消化至溶液呈透明的藍綠色。其后的操作步驟完全相同。這樣可以校正試劑不純所發(fā)生的誤差。

5.2 試樣空白測定

稱取0.5g 分析純蔗糖代替試樣，以后各種試劑的用量及操作步驟完全相同。其標準為，空白測定消耗0.1m o l • L -1 鹽酸標液體積不超過0.2mL；消耗0.02mol •L-1 鹽酸標液體積不超過0.3mL。以上兩個空白測定并不需要每次都要做，隔一段時間操作一次即可，但是在更換藥品試劑、標準溶液時一定要做空白實驗測定。若空白值超標，一般是由于所用試劑級別不夠或不純、蒸餾水不純、玻璃器皿清洗不干凈等原因造成。

6粗蛋白的測定：蒸餾裝置及操作準確性檢測

在進行樣品檢測的同時，精確稱取0.2000g 分析純的硫酸銨代替試樣，直接定容100m L 后進行蒸餾、滴定，測得硫酸銨含氮量為21.19% ±0.2%，以校正蒸餾裝置的氣密性和加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

7粗蛋白的測定：計算時換算系數(shù)的處理

我們在計算蛋白含量時多乘以平均系數(shù)6.25，對于粗蛋白質中含氮量尚未確定的可以乘以平均系數(shù)，對于已經確定的則不妥，以豆粕為例：如果測定豆粕和以豆粕為主要原料的濃縮飼料的粗蛋白質含量時，用6.25 作為蛋白質的換算系數(shù)的話，比大豆的實際換算系數(shù)5.70 擴大了0.54倍，相對誤差將在8% 左右，因此對于已經確定的換算系數(shù)就用實際系數(shù)來換算，例如蕎麥、玉米用系數(shù)6.00，大豆、豌豆、蠶豆、燕麥、小麥、黑麥、箭舌草等用系數(shù)5.70，黃豆用系數(shù)5.71，大麥用系數(shù)5.83，棉籽、芝麻、葵花籽用系數(shù)5.30，花生用系數(shù)5.46，全脂大豆粉用系數(shù)5.72，牛奶用系數(shù)6.38。以上是用凱氏定氮法測定飼料中蛋白質含量的一些體會、經驗，與大家共同探討。